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Vectores de Expresión en E. coli

  • Vectores pALEXa, b y c
    Los vectores pALEXa, b y c contienen el dominio 3´ del gen lytA (proteína C-LYTAG) de Streptococus pneumoniae entre el promotor Pm y el sitio de clonación múltiple. Estos vectores permiten la expresión de proteínas de fusión a C-LYTAG con el sistema CASCADE™.

    El sitio de clonación múltiple de los pALEX contiene 7 sitios de restricción únicos: BamHI, Xhol, Sacl, BgIll, BstBI y HindIII. Éstos sitios están disponibles en las tres fases abiertas de lectura (pALEXa, pALEXb, pALEXc) para facilitar la fusión traduccional del gen de interés a la región codificante de C-LYTAG.

    Los vectores pALEX contienen el marcador de selección bla, que confiere resistencia a ampicilina, e incluyen la secuencia codificante para un sitio de reconocimiento de la enteroquinasa que permite eliminar fácilmente el dominio de fusión C-LYTAG.

    Vectores pALEX1a, b y c
    pALEX1a, b y c son vectores bacterianos para la expresión de proteínas con el sistema CASCADE™, que pueden ser utilizados en cepas especializadas de E. coli que porten el módulo regulador nahR/Psal::xylS inducible por salicilato, como REG-1 o REG-12.

    Estos nuevos vectores, de alto número de copias y seleccionables por resistencia a ampicilina incorporan un promotor Pm mutante con menor actividad basal, permitiendo así un mayor control sobre la expresión. Entre otras características, pALEX1a, b y c incluyen una región de clonación múltiple con dianas únicas para 20 enzimas de restricción diferentes, que facilitan la inserción de cualquier secuencia codificante y su fusión traduccional en fase con un codón de inicio ATG situado a una distancia óptima de una secuencia de unión a ribosomas altamente eficiente (RBSII). La región de clonación múltiple incluye en su extremo 3´ tres codones de parada de la traducción, uno en cada fase de lectura, y seguida por dos secuencias terminadoras de la transcripción (t0 y T1).

    Los elementos descritos configuran un módulo de expresión flanqueado por dianas para la enzima de restricción NotI, que permiten transferir fácilmente cualquier construcción realizada en estos plásmidos a los vectores de integración mediada por elementos transponibles pUTmini-Tn5 (Ver Sección de Clonación), para su inserción estable en el cromosoma bacteriano.

    Vectores pALEX2a, b y c
    Los nuevos vectores pALEX2 permiten la expresión, bajo el sistema CASCADE™, de proteínas fusionadas en sus extremos amino a una versión reducida de C-LYTAG, denominada LYTAG, y su posterior purificación o inmovilización mediante el uso de soportes cromatográficos compatibles con la tecnología C-LYTAG. El nuevo tag (136 aminoácidos, 15.21 kD) incorpora una secuencia polipeptídica estructurada en hélice alfa que actúa como elemento espaciador entre el dominio de unión a colina y la proteína de interés, reduciendo la posible interferencia estructural entre ambas regiones y facilitando, si es necesaria, la separación del tag mediante digestión con enteroquinasa, al favorecer el acceso de esta endopeptidasa a su secuencia diana.

    Los vectores pALEX2 están disponibles en 3 fases abiertas de lectura (pALEX2a, pALEX2b y pALEX2c). Los pALEX2 derivan respectivamente de los pALEX1 (pALEX1a, pALEX1b y pALEX1c) y por tanto incluyen sus regiones de clonación múltiple, además de una diana única para la enzima de corte romo PshAI, cuya secuencia solapa con la secuencia codificante de la diana de la enteroquinasa, posibilitando la fusión directa a esta última del polipéptido a expresar y su recuperación sin aminoácidos no deseados en su extremo amino, tras la digestión con la endopeptidasa. Los vectores pALEX2 incluyen el gen marcador de selección bla, que confiere resistencia a ampicilina.

    El módulo de expresión se encuentra flanqueado por dianas para la enzima de restricción NotI, que permiten transferir fácilmente cualquier construcción realizada en estos plásmidos a los vectores de integración mediada por elementos transponibles pUT mini-Tn5 (Ver Sección de Clonación), para su inserción estable en el cromosoma bacteriano.

    pCNB4-S2
    pCNB4-S2 es un plásmido que alberga un trasposón mini-Tn5 Km diseñado para la integración estable del módulo de regulación del CASCADE™ en el cromosoma de una amplia variedad de bacterias Gram negativas. pCNB4-S2 transfiere un elemento móvil que expresa xylS bajo el control del promotor Psal y su análogo de respuesta a salicilato, el regulador nahR. La transposición del módulo regulador del sistema CASCADE™ de pCNB4-S2 depende de la expresión de un gen codificante de una transposasa presente en este plásmido, en una posición externa al elemento transponible, de manera que, al no poder replicarse pCNB4-S2 en la bacteria receptora, el elemento transponible permanece de manera estable en su punto de inserción en el cromosoma bacteriano.

    pCCD5
    pCCD5 es un vector de 3,4 Kb y 20-40 copias, derivado de ColE1, utilizado para la clonación y la expresión de genes de proteínas en E. coli con el sistema CASCADE™. pCCD5 contiene el promotor Pm precedido de un terminador transcripcional y situado “corriente arriba” del sitio de clonación múltiple, que incluye una eficiente región de inicio de la traducción.

  • Cepas Relacionadas
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    RS-4756 Elution Solution 3M (LYTAG Sistema de Purificación en Dos Fases) 25 ml
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    Vectores pALEXa, b and c:
    EV-3240 pALEX-a 8µgEV-3241 pALEX-b 8µgEV-3242 pALEX-c 8µgEV-3413 pALEX a b & c 8µg/cada unoEV-3243 pALEX-lacZ 8µgEV-3435 pALEX 2-Ca 8µg

    Vectores pALEX1a, b and c:
    EV-3439 pALEX1 a 8µgEV-3440 pALEX1 b 8µgEV-3441 pALEX1 c 8µgEV-3462 pALEX1 a, b & c 8µg/cada uno

    Vectores pALEX2a, b and c:
    EV-4643 pALEX2 a 8µgEV-4644 pALEX2 b 8µgEV-4645 pALEX2 c 8µgEV-4658 pALEX2 a, b & c 8µ/cada unoEV-4724 p414GAL1-GAL4ERVP16 8µg

    Vector pCNB4-S2:
    EV-3407 pCNB4-S2 8µg

    Vector pCCD5:
    EV-3408 pCCD5 8µg

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